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Jul 17, 2023

Progettazione del batteriofago T4

Nature Communications volume

Nature Communications volume 14, numero articolo: 2928 (2023) Citare questo articolo

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La progettazione di vettori virali artificiali (AVV) programmati con biomolecole che possono entrare nelle cellule umane ed effettuare riparazioni molecolari avrà ampie applicazioni. Qui, descriviamo un approccio in catena di montaggio per costruire AVV ingegnerizzando i componenti strutturali ben caratterizzati del batteriofago T4. A partire da un guscio capside di 120 × 86 nm che può ospitare DNA da 171 Kbp e migliaia di copie proteiche, varie combinazioni di biomolecole, inclusi DNA, proteine, RNA e ribonucleoproteine, vengono incorporate esternamente e internamente. Le nanoparticelle vengono quindi rivestite con lipidi cationici per consentire un ingresso efficiente nelle cellule umane. Come prova del concetto, assembliamo una serie di AVV progettati per fornire il gene della distrofina a lunghezza intera o eseguire varie operazioni molecolari per rimodellare il genoma umano, tra cui l'editing del genoma, la ricombinazione genetica, la sostituzione genetica, l'espressione genica e il silenziamento genico. Questi AVV basati su fagi di grande capacità, personalizzabili, multiplex e all-in-one rappresentano un’ulteriore categoria di nanomateriali che potrebbe potenzialmente trasformare le terapie geniche e la medicina personalizzata.

I virus sono gli organismi più abbondanti e diffusi sulla Terra. Sono anche alcune delle macchine biologiche più efficienti1,2. Nonostante le loro piccole dimensioni e la semplice composizione genetica, i virus possono causare infezioni mortali e pandemie globali, come l’AIDS, l’influenza e il COVID-19. Questo perché i virus hanno sviluppato meccanismi efficienti per replicarsi e assemblare la progenie in tempi rapidi, dell'ordine di minuti nel caso di virus batterici (batteriofagi o semplicemente fagi)3,4. Se alcuni degli efficienti meccanismi virali potessero essere sfruttati costruendo vettori virali artificiali (AVV), programmati con molecole terapeutiche, tali virus, invece di replicarsi nell’ospite, potrebbero eseguire riparazioni benefiche per ripristinare la salute umana. Tali AVV potrebbero potenzialmente sostituire geni difettosi, produrre molecole terapeutiche, uccidere cellule tumorali e così via5,6,7,8,9,10. Nonostante i numerosi tentativi nel corso degli anni6,11, lo sviluppo degli AVV è rimasto in una fase iniziale.

I virus umani naturali, i virus adeno-associati (AAV) con genoma di DNA a filamento singolo di dimensioni di ~ 5 Kbp e i lentivirus con genoma di RNA a filamento singolo di dimensioni di ~ 10 Kbp, sono stati progettati per fornire DNA o RNA terapeutico come parte del loro genoma12,13 ,14. Tuttavia, questi vettori virali presentano dei limiti. Nel migliore dei casi possono fornire uno o due geni terapeutici e pongono difficoltà nell’incorporare ulteriori molecole terapeutiche essenziali per riparazioni complesse. Ulteriori problemi seri riguardano la sicurezza, come l'ampia infettività delle cellule umane, l'immunità preesistente e la potenziale integrazione nel genoma ospite14,15.

Qui descriviamo una piattaforma AVV utilizzando il fago T4. T4 appartiene alla famiglia degli Straboviridae e infetta il batterio Escherichia coli16,17. Con un'efficienza dell'infezione prossima al 100%18 e una velocità di replicazione di circa 20-30 minuti per ciclo19, T4 è uno dei virus più efficienti conosciuti. Contiene un grande capside icosaedrico prolato (testa) di 120 × 86 nm assemblato con 930 molecole o 155 capsomeri esamerici della principale proteina del capside gp23* (* rappresenta la forma matura scissa), 55 copie o 11 pentameri di gp24* in undici delle dodici vertici e 12 copie della proteina portale gp20 nell'unico dodicesimo vertice (Fig. 1a-c)20,21,22. Il vertice del portale è una struttura ad anello con un canale centrale di ~ 35 Å attraverso il quale il genoma virale viene trasportato nel capside da un motore molecolare pentamericano alimentato da ATP ad esso collegato (Fig. 1c)23,24,25. Dopo che una testata di genoma, equivalente a un dsDNA lineare di ~ 171 Kbp, è stata confezionata26,27, il motore si dissocia e le proteine ​​del collo si assemblano seguite dall'assemblaggio della coda e della fibra della coda per generare un virione infettivo28,29,30,31.

un modello strutturale della testa del fago T4 (capside)44. I vertici pentamerici gp24 sono mostrati in rosso. b Il capsomero ingrandito mostra la disposizione esamerica della principale proteina del capside gp23 (verde scuro), trimeri Soc (verde chiaro) e fibra Hoc (ciano)44. c Modello strutturale ingrandito della macchina per l'imballaggio del DNA composto dal dodecamero del portale gp20 (PDB 3JA7) (marrone) e dal motore di imballaggio del DNA pentamericano gp17 (PDB 3CPE) (giallo)24,44. d Ottocentosettanta molecole Soc assemblate sui quasi tre assi formano una gabbia molecolare attorno al capside21 di T4 (PDB 5VF3). e Centocinquantacinque fibre Hoc emanano dai centri dei capsomeri34 (PDB 3SHS). f, g Le superfici molecolari del capside 22 T4 wild-type (WT) (3,4 Å, PDB 7VS5) (f) e del capside 9DE-T4 superacido (3,9 Å) (g) sono colorate in base al potenziale elettrostatico. Il colore varia dal rosso, corrispondente a un potenziale di −5 kT/e−, al blu, corrispondente a un potenziale di +5 kT/e−. Il capside WT-T4 ha 6.829 cariche negative nette e il capside 9DE-T4 ha 15.199 cariche negative nette. h Schema di una testa impacchettata con proteine ​​e DNA estranei nel suo spazio interno.